Des chercheurs qui travaillaient sur des souris ont découvert qu’en éditant des gènes, ils ajoutaient involontairement de l’ADN bovin, de l’ADN de chèvre et de l’ADN bactérien.

jeudi 26 septembre 2019
par  Yan lou Pec
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Qui n’a pas entendu parler de ces nouvelles techniques extraordinairement « précises » qui permettent d’insérer ou de modifier un gène exactement là où on veut ?

Pourtant, ces méthodes souvent appelées « édition de gène » sont en fait tout aussi imparfaites et aléatoires que le génie génétique d’hier. Lors de l’utilisation de ces techniques d’édition de gènes (CRISPR, Talens, nucléases à doigt de zinc), de l’ADN clandestin est aussi inséré dans le génome hôte. Il peut s’agir d’ADN de virus, de bactéries, d’insectes, de gènes de résistance aux antibiotiques, etc...

C’est d’autant plus inquiétant que ces phénomènes ont été observés lors de l’utilisation de méthode standard de l’édition de gènes et que l’industrie est plus préoccupée par la commercialisation rapide de ses produits que de s’assurer de leur innocuité.

Ces dernières découvertes démontrent combien il est nécessaire que les citoyens se mobilisent face aux pressions des lobbies industriels pour exiger un encadrement étroit de ces nouveaux OGM et le maintien d’une règlementation stricte.

Les Amis de la Terre des Landes

Par Jonathan Latham, PhD

Nombreux sont ceux qui considèrent que l’édition de gènes dans des cellules vivantes est l’avancée technologique majeure de ce nouveau millénaire. Les chercheurs en médecine et en agriculture l’ont rapidement adoptée comme technique pour découvrir des fonctions des cellules et des organismes. Mais les perspectives commerciales de l’édition de gènes sont beaucoup plus compliquées.

L’édition de gènes a de nombreuses utilisations potentielles. Elles vont de la modification des cellules pour traiter les maladies humaines à la modification des cultures et du bétail pour l’élevage et l’agriculture. En outre, dans le cadre d’une expérience fortement critiquée, le chercheur chinois He Jiankui affirme avoir édité des bébés humains et modifié un gène appelé CCR5, afin qu’ils résistent au virus HIV.

L’intérêt de l’édition de gène pour la plupart des applications commerciales, réside dans sa simplicité et sa précision : elle modifie des génomes sur des sites précis sans insérer d’ADN étranger. C’est la raison pour laquelle, dans des articles populaires, l’édition de gènes est souvent appelée « ciseaux ».

Ce discours bien rodé sur les ciseaux ne repose que sur des affirmations et non sur des faits établis. De plus, il a récemment été sérieusement ébranlé. À la fin du mois de juillet, des chercheurs de l’Administration de l’Alimentation et des Médicaments (FDA) des États-Unis ont complètement analysé les génomes des deux veaux nés en 2016. Les veaux ont été édités par la startup de biotechnologie Recombinetics à l’aide d’une méthode d’édition de gènes appelée TALENS (Norris et al., 2019). ). Les deux animaux de Recombinetics étaient devenus célèbres dans le monde des biotechnologies pour être le résultat d’une modification génétique qui avait supprimé leurs cornes. Les bovins sans cornes sont appelés « élus ». Les veaux sont bien connus parce que Recombinetics a insisté sur le fait que ses deux animaux édités étaient modifiés avec une précision extrême pour ne posséder que le trait élu.

Pourtant, ce que les chercheurs de la FDA ont découvert n’a rien à voir avec de la précision. Chacun des veaux de Recombinetics possédait deux gènes de résistance aux antibiotiques, ainsi que d’autres segments d’ADN bactérien clandestin. C’est ainsi que, apparemment à l’insu de Recombinetics, près de 4 000 paires de bases d’ADN provenant du vecteur plasmidique utilisé pour introduire l’ADN requis pour le caractère "sans corne" avoisinaient le site du gène édité.
 
Les révélations de la FDA ont attiré quelque peu l’attention des médias, mais ils se sont essentiellement concentrés sur l’incompétence de Recombinetics. La startup n’a pas été capable de trouver (ou peut-être de chercher) l’ADN qu’elle avait elle-même ajouté dans le cadre du processus d’édition. Conséquence des découvertes de la FDA, le Brésil a mis fin à un programme de sélection commencé avec les animaux de Recombinetics.

Mais les découvertes de la FDA pourraient paraître banales comparées à une autre découverte récente concernant l’édition de gènes : cet ADN étranger provenant de sources surprenantes peut se retrouver de façon routinière dans le génome des animaux édités. Ce matériel génétique n’est pas de l’ADN qui a été inséré là volontairement, mais il s’agit plutôt d’une pollution génétique lors des procédures standard d’édition.

Les médias scientifiques ou populaires n’ont pas ébruités ces résultats. Pourtant, ils ont des conséquences très importantes sur le plan de la biosécurité et donc dans les domaines de la règlementation et de la commercialisation de l’édition des gènes. Ils impliquent, au strict minimum, que des mesures fortes soient prises pour empêcher toute contamination par de l’ADN parasite et qu’il faille procéder à un examen approfondi des cellules et des organismes modifiés par édition de gènes. Et, comme le laisse penser l’affaire Recombinetics, il se pourrait que les développeurs eux-mêmes ne soient pas capables de satisfaire ces exigences.

Comprendre les sources d’ADN parasite

En 2010 déjà, des chercheurs travaillant avec des cellules humaines avaient montré qu’une forme d’édition de gène appelée nucléase à doigt de zinc (ZFN) pouvait entraîner l’insertion d’ADN étranger sur le site cible de l’édition (Olsen et al., 2010). Comme pour les veaux de Recombinetics, cet ADN étranger avait pour origine le vecteur plasmidique utilisé dans le processus d’édition.

La présence de vecteurs plasmidiques n’est compréhensible que si l’on comprend les fondements de l’édition de gènes, fondements qui n’ont vraiment pas grand chose à voir avec ce qu’on entend en français ordinairement par le mot « édition ».

En fin de compte, toute « édition » d’ADN consiste en réalité à découper l’ADN avec des enzymes, appelées nucléases, qui sont censées n’agir que sur les sites choisis dans le génome d’une cellule vivante. Cette coupe provoque une rupture à double brin qui sectionne (et donc endommage gravement) un chromosome. Les enzymes les plus couramment utilisées par les chercheurs pour cette opération sont le Fok I (pour l’édition de type TALENS), le Cas9 (pour CRISPR) ou les nucléases à doigt de zinc (pour ZFN).

Suite à ce sectionnement, la cellule effectue une réparation. Dans la pratique, cette réparation de l’ADN est généralement imprécise car le mécanisme de réparation naturel de la plupart des cellules est quelque peu aléatoire. C’est ce résultat que l’on appelle l’ « édition ». Généralement, les chercheurs doivent faire le tri parmi plusieurs « éditions » pour obtenir celle qu’ils désirent.

Ces nucléases sont, comme pratiquement toutes les enzymes, des protéines. Et comme la plupart des protéines, il est un peu délicat de les produire et elles demeurent relativement instables une fois produites. Par conséquent, plutôt que de produire directement les enzymes qui coupent l’ADN, les chercheurs introduisent généralement des plasmides vectoriels dans des cellules cibles. Ces plasmides vectoriels sont des molécules d’ADN circulaires qui codent la ou les enzymes souhaitées. (L’ADN du plasmide vectoriel peut également coder l’ARN guide nécessaire pour les techniques d’édition CRISPR). Cela signifie en pratique, que TALENS, Cas9 et les autres enzymes coupeuses sont finalement produites par la cellule cible elle-même.

Sur le plan de la recherche, il est donc beaucoup plus facile d’introduire de l’ADN que des protéines, mais il y a un inconvénient : l’ADN non hôte (c’est-à-dire transgénique) doit être introduit dans la cellule à éditer et cet ADN peut se retrouver dans le génome.

Les vecteurs plasmidiques ne sont pas des éléments simples. Non seulement, le vecteur plasmidique utilisé par Recombinetics déterminait les nucléases, mais il contenait aussi des gènes de résistance aux antibiotiques, le gène lac Z, plus des séquences de promoteur et de terminaison pour chacun d’eux, ainsi que deux origines de réplication bactériennes. Chacun de ces composants d’ADN provient de bactéries très diverses.

Comme Olsen et al. et la FDA l’ont démontré, l’utilisation des types de ciseaux d’ADN, TALENS et ZFN, peut entraîner l’intégration du vecteur plasmidique au niveau du site visé. En 2015, des chercheurs japonais ont montré que les modifications de l’ADN effectuées sur des zygotes (cellules vivantes, encore non divisées, résultant d’une fécondation) de souris en utilisant la méthode d’édition de gènes CRISPR sont également vulnérables à l’insertion non intentionnelle d’ADN non hôte (Ono et al., 2015).

Depuis lors, des intégrations similaires d’ADN étranger sur le site cible ont été observées chez de nombreuses espèces : mouches des fruits (Drosophila melanogaster), poissons medaka (Oryzias latipes), souris, levures, Aspergillus (un champignon), nématode C. elegans, Daphnia magna et diverses plantes (Voir Jacobs et al., 2015 ; Li et al., 2015 ; Gutierrez-Triana et al., 2018).

Autres sources d’ADN parasite

Les plasmides vectoriels eux-mêmes ne sont pas la seule source de contamination potentielle par de l’ADN étranger dans les méthodes standard d’édition de gènes.

En début d’année, le même groupe japonais démontrait que l’ADN du génome d’E. coli (une bactérie intestinale) pouvait s’insérer dans le génome des organismes cibles (Ono et al. 2019). Il s’est avéré que l’acquisition d’ADN d’E. coli était relativement fréquente. L’insertion de longues séquences d’ADN non intentionnelles se produisait dans 4% du nombre total de sites édités et pour 21% d’entre eux, il s’agissait de l’ADN du génome d’E. coli. Les chercheurs sont remontés jusqu’à la source de l’ADN d’E. coli : il s’agit des cellules d’E. coli qui avaient été utilisées pour produire le plasmide vectoriel. Ce dernier, lui même composé d’ADN, était contaminé par l’ADN du génome d’E. coli. Ce qui est à noter, c’est que les chercheurs japonais utilisaient des méthodes standard de préparation de plasmides vectoriels.

Encore plus étonnante fut la découverte citée dans ce même article, que des génomes de souris édités pouvaient acquérir de l’ADN de bovin ou de caprin (Ono et al., 2019). Cela était imputable à l’utilisation, dans un milieu de culture standard pour des cellules de souris, de sérum de veau foetal, c’est-à-dire de fluides corporels habituellement extraits des vaches. Quelle que soit l’espèce animale dont provient ce sérum, il contient de l’ADN de cette espèce, ce qui explique l’insertion d’ADN de chèvre dans certaines expériences, lorsque du sérum de chèvre a été utilisé au lieu de sérum de veau.

Ce qui est encore plus inquiétant, c’est que parmi les séquences d’ADN insérées dans le génome de la souris, des rétro-transposons bovins et caprins (gènes sauteurs) ainsi que de l’ADN de rétrovirus de souris (le HIV est un rétrovirus) sont aussi présents. L’édition de gènes s’avère donc être un mécanisme potentiel de transfert horizontal de gènes provenant d’agents pathogènes indésirables dont des virus.

Les cultures de cellules utilisées pour l’édition de gènes présentent aussi d’autres sources potentielles d’ADN non désiré. En 2004, des chercheurs observaient que, lorsqu’on provoquait des ruptures d’ADN dans des cellules d’une lignée de cellules d’hépatome (tumeur du foie), certaines de ces ruptures étaient comblées par des séquences du virus de l’hépatite B (Bill et Summers, 2004). En d’autres termes, on devrait aussi s’inquiéter des agents pathogènes qui contaminent le sérum fœtal, comme les virus à ADN.

De plus, l’insertion d’ADN clandestin d’autres espèces ne se limite probablement pas au site ciblé. Il est maintenant reconnu que les enzymes d’édition de gènes peuvent agir dans le génome, à des emplacements non intentionnels (Kosicki et al., 2018). L’ADN introduit accidentellement peut également se retrouver sur de tels sites. Cela a été démontré pour les cellules humaines et pour les plantes utilisant CRISPR (Kim et Kim 2014 ; Li et al., 2017 ; Jacobs et al., 2015). Il y a tout lieu de penser que les ADN plus exotiques mentionnés ci-dessus peuvent également s’y insérer, mais il n’y a pas eu de recherches spécifiques.

Implications de l’ADN clandestin dans les cellules éditées

En résumé, ces nouvelles constations sont très simples : quel que soit le type précis d’édition de gènes, le fait de sectionner l’ADN à l’intérieur des cellules, favorise l’acquisition d’ADN indésirable par les génomes. L’ADN indésirable peut provenir, accidentellement ou délibérément, soit de l’intérieur de la cellule éditée, soit du milieu de culture, soit de tout matériel biologique ajouté au milieu de culture. C’est pourquoi, il est facile d’imaginer, par exemple, que des animaux obtenus par édition de gènes deviennent les animaux de reproduction qui entraînent le développement ou la propagation de virus ou de mycoplasmes nouveaux ou indésirables.

Stuart Newman du New York Medical College est biologiste cellulaire, membre fondateur du Council for Responsible Genetics et rédacteur en chef de la revue Biological Theory. D’après lui, l’ADN supplémentaire provenant de la culture cellulaire « est quelque chose qui n’a pas été abordé dans le discours sur la sécurité de CRISPR et des autres techniques de modification des génes ».

Pour Newman, dans le cas de l’édition de gènes visant à générer des organismes vivants modifiés, les milieux de culture cellulaire « contiennent des gènes qui pourraient causer des problèmes de développement si, à l’aide de CRISPR / Cas9, on les réinséraient en surnombre et dans des sites chromosomiques incontrôlés, dans le génome du zygote ».

« Il ne fait pratiquement aucun doute que l’ADN d’E. coli a été incorporé accidentellement dans de nombreuses cibles de CRISPR, et il est probable qu’il provoque des problèmes, comme dans le cas des bovins à cornes. »

On peut avoir les mêmes inquiétudes vis-à-vis des applications chez les humains. Le problème de l’incorporation d’ADN d’autres espèces n’a pas été soulevé publiquement pour les bébés humains modifiés à l’aide de l’édition de gènes par le chercheur He Jiankui. De toute évidence, ce problème devrait pourtant être soulevé. Par exemple, à partir de quels types de cellules, He Jiankui a-t-il purifié les protéines qu’il a vraisemblablement utilisées pour éditer le gène CCR5 ? Est-ce que ce sont des cellules de lapin ? Des cellules d’insectes ? En tout cas, ce sont celles que l’on retrouve dans les méthodes standard.

La deuxième conclusion importante que l’affaire Recombinetics illustre de façon exemplaire, c’est que les chercheurs ne recherchent pas souvent l’ADN égaré. Par contre s’ils le recherchaient, de nombreux autres exemples seraient probablement signalés. Nous pouvons affirmer cela parce que les recherches citées ci-dessus utilisaient des méthodes standard d’édition de gènes. Le seul aspect inhabituel a été l’effort accru déployé pour détecter l’ADN clandestin.

Edition de gènes versus OGM

Ces découvertes récentes mettent également en relief un aspect plus général, mais peu discuté de l’édition de gènes. Bien que les objectifs de l’édition de gènes et du génie génétique soient censés être très différents, leurs méthodes standard sont pratiquement impossibles à distinguer.

Examinons le cas des végétaux cultivés, sur lesquels se concentre la majeure partie de l’intérêt commercial immédiat pour l’édition de gènes. Pour éditer des plantes, l’ADN est introduit sous forme de plasmide vectoriel dans les cellules. Contrairement aux méthodes d’édition de gènes chez les animaux, ce plasmide vectoriel est nécessaire (et non optionnel) car les protéines ne peuvent pas pénétrer les parois cellulaires des plantes. Ce plasmide vectoriel doit accéder à l’intérieur de la cellule, ce qui nécessite soit un pistolet à gènes soit une infection par la bactérie transférant l’ADN, Agrobacterium tumefaciens. Et pour finir, on utilise une culture cellulaire in vitro pour qu’à partir des cellules éditées, des plantes complètes soient régénéres.

Les pistolets à gènes, la culture tissulaire et A. tumefaciens sont des méthodes standard de génie génétique pour les plantes destinées aux cultures. Mais toutes provoquent aussi des mutations. En clair, elles endommagent l’ADN. Suivant les spécificités de la méthode utilisée, comme la durée de la culture tissulaire, le résultat d’ensemble peut s’élever à dix mille mutations par génome (Wilson et al., 2006 ; Latham et al., 2006). Pour l’édition de gènes de plantes cultivées, cela signifie qu’une mutation sur la cible peut être éclipsée par des milliers d’autres hors cible.

L’autre comparaison nécessaire avec les OGM est le fait bien connu que l’on a retrouvé de l’ADN étranger non intentionnel dans leurs génomes, bien après leur mise sur le marché. La papaye résistante à un virus de Cornell disséminée à Hawaii, s’est avérée contenir au moins cinq (voire six) fragments distincts d’ADN transgénique. Cornell avait auparavant indiqué aux organismes de régulation que sa papaye contenait deux transgènes (Ming et al., 2008). Des chercheurs indépendants ont découvert que le soja Roundup Ready de Monsanto, couvrant à ce moment là 96% de la superficie cultivée en soja aux États-Unis, possédait bien plus d’ADN étranger que ce qu’avait affirmé Monsanto (Windels et al., 2001).

Si l’on n’écoutait que le discours opposant la « précision » des « ajustements » obtenue par l’édition de gènes au côté « brouillon » et « aléatoire » du génie génétique, on aurait vraiment grande peine à soupçonner que, dans le cas des plantes et souvent aussi des animaux, la différence est minime entre la réalité de l’édition de gènes et celle du génie génétique.

Y a-t-il des solutions à la présence d’ADN clandestin ?

Les solutions pour éviter la présence d’ADN clandestin (sur le site d’édition ou éloigné de celui-ci) reviennent essentiellement soit à prévenir soit à dépister puis retirer.

Une mesure préventive évidente consiste à éviter l’utilisation de plasmides vectoriels et de milieux de culture non définis (les milieux non définis sont ceux qui contiennent des fluides ou des extraits d’organismes vivants). Une autre consiste à sélectionner précisément (rétro-croisement) des animaux et des plantes obtenus par édition de gènes afin de supprimer les séquences d’ADN clandestin. Une troisième voie consiste à séquencer complètement leur génome, à le comparer au génome parent et à ne sélectionner que les lignées non modifiées, si on peut les trouver (Ahmad et al., 2019).

Mais toutes ces solutions demandent beaucoup d’efforts. Elles exigent beaucoup de temps et d’argent, et ne sont pas encore complètement mises au point ou suelement disponibles pour certaines espèces. De plus, ces solutions finissent par annuler les avantages de l’édition de gènes - rapidité et facilité -, qui sont souvent les premiers arguments avancés en faveur de celle-ci.

Le second problème majeur est le manque d’intérêt qu’affiche l’industrie, et pas seulement Recombinetics, pour procéder elle-même à des vérifications, ce qui s’explique en grande partie par les exigences en matière d’expertise et les efforts requis. Aujourd’hui, il est encore plus dans l’air du temps que lors de l’avènement des OGM, de se comporter comme des cow-boys : on balaye les problèmes d’un revers de main et on se précipite sur la commercialisation. C’est pour cela que la grande majorité des entreprises d’édition de gènes sont peu disposées à partager des informations et que, de ce fait, on sait très peu de choses sur la façon dont, dans la pratique, beaucoup d’entre elles obtiennent leurs produits par « édition de gènes ».

Actuellement, de nombreux pays mettent au point des réglementations qui aideront à déterminer au profit et au détriment de qui l’édition de gènes pourrait apporter quelques avantages potentiels. Dans tous les cas, ces résultats montrent qu’il est impératif que les gouvernements surveillent tout cela de près.

Mais ce n’est pas uniquement aux organes de réglementation d’agir. Les investisseurs, les assureurs, les journalistes, en fait chacun d’entre nous devrait en fait poser beaucoup plus de questions aux scientifiques et aux entreprises qui opèrent dans le domaine de l’édition de gènes. Sinon, il est probable que l’essor actuel ne se termine en fléau.

(Illustration tirée du rapport des Amis de la Terre Etats-Unis : Genetically Engineered Animals)

Traduction de Christian Berdot, relecture par Gérard et Marie-Claire Dupouy, Amis de la Terre des Landes.

Article publié le 23 septembre 2019, sur le site Independant Science News.

(Lien https://www.independentsciencenews.org/health/gene-editing-unintentionally-adds-bovine-dna-goat-dna-and-bacterial-dna-mouse-researchers-find/)

(Illustration tirée du rapport des Amis de la Terre Etats-Unis : Genetically Engineered Animals)

Article aussi sous forme de pdf :

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Edition de gènes et ADN clandestin

Références

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Gutierrez-Triana, Jose Arturo, Tinatini Tavhelidse, Thomas Thumberger , Isabelle Thomas, Beate Wittbrodt, Tanja Kellner, Kerim Anlas, Erika Tsingos, Joachim Wittbrodt (2018) Efficient single-copy HDR by 5’ modified long dsDNA donors. eLife 2018 ;7:e39468. 

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